1550年9月24日（嘉靖二十九年八月十四日），汤显祖出生于一个书香世家。原居临川文昌里（今临川文昌桥东太平街汤家山），后移居沙井巷，建“玉茗堂”（内有揽秀楼、清远楼、毓霭池、金柅阁等），故又自号清远道人，晚年又号茧翁。其祖上4代均有文名：高祖、曾祖藏书、好文；祖父汤懋昭，字日新，博览群书，精黄老学说，善诗文，被学者推为“词坛名将”；父亲汤尚贤是个知识渊博的儒士，为明嘉靖年间著名老庄学者、养生学家、藏书家，重视家族教育，为弘扬儒学，他在临川城唐公庙创建“汤氏家塾”，并聘请江西理学大师罗汝芳为塾师，课教宗族子弟，生子汤显祖、汤儒祖、汤奉祖（汤凤祖）、汤会祖、汤良祖、汤寅祖；伯父汤尚质酷爱戏曲，还从事过戏曲活动，母亲自幼熟读诗书。
虽然汤懋昭、汤尚贤父子门派不同，但均是满腹经纶的学者，祖辈的认真求学的态度，在汤显祖幼小的心灵中打下深刻的烙印。汤显祖天资聪慧，从小受家庭熏陶，勤奋好学。5岁时进家塾读书，12岁能诗，13岁（嘉靖四十一年）从徐良傅学古文词，14岁便补了县诸生。21岁中了举人。按他的才学，在仕途上本可望拾青紫如草芥了。但是，跟随整个明代社会一起堕落的科举制度已经腐败，考试成了上层统治集团营私舞弊的幕后交易，成为确定贵族子弟世袭地位的骗局，而不以才学论人。1577年（万历五年）、1580年（万历八年）两次会试，当朝首辅张居正要安排他的几个儿子取中进士，为遮掩世人耳目，又想找几个有真才实学的人作陪衬。他打听到海内最有名望的举人无过于汤显祖和沈懋学等人，就派了自己的叔父去笼络他们。声言只要肯同宰相合作，就许显祖等中在头几名。以宰相之威势，加以许多人梦寐以求的诱惑，沈懋学等出卖了自己，果然中了高科；但汤显祖却洁身自好，一无所动。他虽然并不反对张居正的政治改革，但作为一个正直的知识分子，他憎恶这种腐败的风气，因而先后两次都严峻地拒绝了招揽。说：“吾不敢从处女子失身也。”结果是可想而知的：汤显祖名落孙山。而且，在张居正当权的年月里，他永远落第了。但因此，汤显祖却以高尚的人格和洁白的操守，得到海内人士的称赞。张居正死后，张四维、申时行相继为相，他们也曾许他以翰林的地位拉显祖入幕，显祖都拒绝了。34岁，汤显祖以极低的名次中了进士，布满荆棘的仕途从此开始。他先在北京礼观政（见习），次年以七品官到南京任太常寺博士。一住七年。自永乐以来，南京是明朝的留都。虽各部衙门俱全，实际上毫无权力，形同虚设，太常寺尤为其中的闲职。有人咏之于诗曰：“印床高阁网尘纱，日听喧蜂两度衙。”其闲寂可想而知。然而，当时南京却是文人荟萃之地，诗文家不论，即戏曲家，前后就有徐霖、姚大声、何良俊、金在衡、臧懋循诸名家。汤显祖在此，一面以诗文、词曲同一些人切磋唱和，一面研究学问，作书中蠹鱼。虽至夜半，书声琅琅不绝于口。别人问他：“老博士何为嗜书？”答曰：“吾读书不问博士非博士。”这种恬淡自得的生活正同因投靠张居正而终于在这时被严加处分的文人形成鲜明的对照。
留都也不太平。这里正进行着文学思想的激烈斗争。早在嘉靖时代，文坛上就盛行着李梦阳、何景明为首的前七子倡导的“文必秦汉、诗必盛唐”的风气；万历期间，以王世贞、李攀龙为首的后七子步其后尘，有加无已。风气所及，一时有所谓前五子、后五子、广五子、续五子、末五子之类。其中王世贞不仅有才能，而且有地位和势力。1583年（万历十一年），他以应天府尹的身份赴南京，后在这里为刑部侍郎、尚书，地位显赫。士大夫趋之若鹜。许多人奔走在他门下。他的片言只语，便可“翕张贤豪，吹嘘才俊”，俨然为文坛盟主。可是，汤显祖是一个尊重文学而不屈服于权势的人，他重创新而反对复古，他注意汲取古代一切优秀的文学遗产而不为复古派所规定的范围所局限。他的文学思想和旨趣与王世贞辈大相径庭。因此，他虽与王世贞同在南都，且又为王世贞之弟世懋的直接下属，却不愿与王氏兄弟相往还。他写信给朋友说：“无与北地诸君接逐之意，北地诸君亦何足接逐也。”更有趣的是，汤显祖为揭露文学复古派的真面貌，还约了友人把李梦阳、李攀龙、王世贞的诗文拿来解剖，划出他们诗文中模拟、剽窃汉史唐诗的字句，涂涂抹抹，一一作俎上之论。王世贞知道后，也无可如何，哑然失笑而已。这表明，汤显祖不仅不以权势是从，而且当复古文学思潮笼罩海内时，他有主见，有特识，决不随波逐流。这不是说汤显祖有一种先天性的反抗性格，这实际上是他接受古代优秀的文化思想、特别是在当时历史条件下接受了资本主义萌芽时期反理学、反传统、反专制的思想影响的结果。明代中期，随着资本主义萌芽的出现，在哲学上，出现了王艮、何心隐、罗汝芳、李贽等离经叛道的思想家。他们的观点虽不尽相同，但都以掀翻天地的雄心，赤手缚龙蛇的气概，痛斥口谈道德而心存富贵的伪君子，并以“非圣无法”自命。在思想文化上造成了很大的影响。汤显祖早年就做了罗汝芳的学生，自小跟他学道，读“非圣之书”。后来又与激进的禅宗大师紫柏交朋友，尤其敬仰激进的思想家李贽，读其《焚书》，十分倾慕。他说：“如明德先生者（汝芳），时在吾心眼中矣，见以可上人（紫柏）之雄，听以李百泉（贽）之杰，寻其吐属，如获美剑。”形成了他政治上、文学上的反抗性和斗争性，也被人称之为“狂奴”。这样，他不仅在品格上不愿与专制的统治者同流合污，而且在政治上锋芒毕露。
1591年（万历十九年），汤显祖在南京礼部祠祭司主事的任上，上了一篇《论辅臣科臣疏》，严词弹劾首辅申时行和科臣杨文举、胡汝宁，揭露他们窃盗威柄、贪赃枉法、刻掠饥民的罪行，疏文对万历登基二十年的政治都作了抨击。疏文一出，神宗大怒，一道圣旨就把汤显祖放逐到雷州半岛的徐闻县为典史。一年后遇赦，内迁浙江遂昌知县。在遂昌，他“去钳剭（杀戮），罢桁杨（加在脚上或颈上以拘系囚犯的刑具），减科条，省期会”，建射堂，修书院。有时下乡劝农，常年则与青衿子秀切磋文字。这种古循吏的作风，终于使浙中这块僻瘠之地大为改观，桑麻牛畜都兴旺起来。也许汤显祖是把这里当作他的理想王国了，在上述善政之外，竟然擅自放监狱中的囚犯回家过年，元宵节让他们上街观灯，为实施自己的政治主张一无顾忌。这使他的政敌终于抓住了把柄，待考核官员的时机一到，他们就出来暗语中伤。汤显祖自然知道有人想赶走他。1598年（万历二十六年），听说朝廷将派税使来遂昌扰民，他不堪忍受，便不待别人攻击，给吏部递了辞呈；他也不等批准，就扬长而去，回到家乡。后来，吏部和都察院以 “浮躁”为由正式给他一个罢职闲住的处分时，他弃此敝履早过三年。
汤显祖少年时受学于罗汝芳，罗是泰州学派王艮的三传弟子，这一学派承继了王守仁哲学思想中的有积极意义的部分，加以发展，又称“左派王学”。这个学派抨击程朱理学，怀疑封建教条，反对束缚个性。万历年间左派王学的最突出代表人物是李贽。在文学思想上，汤显祖与公安派反复古思潮相呼应，明确提出文学创作首先要“立意”的主张，把思想内容放在首位。这些思想在他的作品中都得到了具体体现。汤显祖虽然也创作过诗文等，但成就最高的还是传奇。他是中国古代继关汉卿之后的又一位伟大的戏剧家。他的戏剧创作现存主要有五种，即“玉茗堂四梦”（或称“临川四梦”）及《紫箫记》。“玉茗堂四梦”即《紫钗记》、《牡丹亭》、《邯郸记》、《南柯记》。这四部作品中，汤显祖最得意，影响最大的当数《牡丹亭》。
汤显祖离遂昌任后，曾在临川和李贽相见。李在狱中自杀后，汤显祖作诗哀悼。他还推崇反理学的达观（紫柏）禅师，称李贽和达观是一“雄”、一“杰”，认为“寻其吐属，如获美剑”。他们的影响在很大程度上构成了汤显祖在创作中表现出来的揭露腐败政治、反对程朱理学和追求个性解放的思想基础。
汤显祖一生蔑视封建权贵，常得罪名人。晚年淡泊守贫，不肯与郡县官周旋。这种性格作风使他同讲究厉行气节、抨击当时腐败政治的东林党人顾宪成、邹元标等交往密切，也使他推重海瑞和徐渭这样“耿介”或“纵诞”的人物。汤显祖的这种性格特点在作品中也有明显反映。《明史》记他“意气慷剀”，“蹭澄穷老”，这评语颇能概括其生平之要。
汤显祖晚年思想比较消极，这同他潜心佛学有关，也同他辞官后长期置身于政治斗争之外有关。他自称“偏州浪士，盛世遗民”，说“天下事耳之而已，顺之而已”。后又以“茧翁”自号。
汤显祖所处的时代，文坛为拟古思潮所左右，继承“前七子”的“后七子”声威机盛。汤显祖21岁时，“后七子”首领李攀龙已去世，但另一首领王世贞继续为文坛盟主，且“独操柄二十年”。汤显祖于青年时期即批评“前七子”的李梦阳、“后七子”的李攀龙、王世贞，指摘他们作品中“增减汉史唐诗字面处”。后更抨击“李梦阳以下”诸人作品“等赝文尔”，并尖锐地说：“赝者名位颇显……其文事关郭体，得以冠玉欺人。”“前后七子”“文必秦汉，诗必盛唐”的主张，根本缺陷是一味摹拟前代作品的永字、造句，乃至改头换面，剽窃前人词句。汤显祖认为“汉宋文章，各极其趣”。他还强调文章之妙在于“自然灵气”，不在步趋形似之间。他的这些主张对后来高揭反拟古旗帜的公安派有一定影响。可以说，在反拟古派过程中，汤显祖是从李贽、徐渭到以袁宏道为首的公安派之间的重要人物。汤显祖诗作，早年受六朝绮丽诗风的影响，为了对抗“诗必盛唐”，后来写诗又曾追求宋诗的艰涩之风，他的这些创作实践并不足以和拟古派相抗衡。汤显祖的古文长于议论，颇有特色。他的书信写得很富感情，文笔流利，为后人所推崇。他还长于史学，修订过《宋史》，惜未完稿。